細(xì)胞灌注培養(yǎng)用Cellgard細(xì)胞截留板—邁博瑞一次性生物反應(yīng)器耗材新品上線

隨著國內(nèi)生物制藥行業(yè)的迅速發(fā)展洁仗，細(xì)胞灌注培養(yǎng)越來越受到人們關(guān)注，因為其可以在較小體積的生物反應(yīng)器中獲得高的細(xì)胞密度，其中細(xì)胞截留裝置是灌流培養(yǎng)工藝開發(fā)非常關(guān)鍵的一項，邁博瑞基于常年在過濾桦踊、分離及純化行業(yè)的積累蒿往，提出了利用深層過濾機(jī)制來應(yīng)對灌流生物反應(yīng)袋過濾部件提出的挑戰(zhàn)咽块，并成功開發(fā)出Cellgard細(xì)胞截留板潮剪。

 

目錄

1.一次性生物反應(yīng)袋發(fā)展進(jìn)程 一次性生物反應(yīng)袋 帶過濾器的一次性生物反應(yīng)袋 一次性灌流生物反應(yīng)袋 2.一次性灌流生物反應(yīng)袋的基本要求 3.一次性灌流生物反應(yīng)袋應(yīng)用及挑戰(zhàn) 一次性灌流生物反應(yīng)袋主要應(yīng)用 一次性灌流生物反應(yīng)袋在高細(xì)胞密度中面臨的挑戰(zhàn) 4.邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板 5.Cellgard細(xì)胞截留板性能實驗分析 實驗一：2L細(xì)胞培養(yǎng) 實驗二：50L細(xì)胞培養(yǎng) 6.邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板的優(yōu)勢

 

一、一次性生物反應(yīng)袋發(fā)展進(jìn)程

1袁稽、一次性生物反應(yīng)袋

1998年勿璃，Wave Biotech公司推出了Wave Bioreactor®搖擺式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用一次性生物反應(yīng)袋Cellbag®作為細(xì)胞及微生物培養(yǎng)容器运提。經(jīng)過市場多年的使用驗證蝗柔，一次性搖擺式生物反應(yīng)器系統(tǒng)及其所配套的耗材，已經(jīng)在全球范圍內(nèi)得到廣泛的接受與認(rèn)可民泵。隨著生命科學(xué)及生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展癣丧，行業(yè)主體對細(xì)胞培養(yǎng)的要求越來越高，更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度栈妆、更短的培養(yǎng)周期胁编、更低的培養(yǎng)成本厢钧、更高的培養(yǎng)成功率等。因此嬉橙，一次性生物反應(yīng)器耗材制備技術(shù)早直、生物培養(yǎng)工藝等學(xué)科也在不斷發(fā)展，更新迭代市框。

圖1：®示意圖（圖片來自GE）

 

2霞扬、帶過濾器的一次性生物反應(yīng)袋

2001年，Dr. Vijay Singh發(fā)明了帶過濾器的一次性生物反應(yīng)袋產(chǎn)品枫振，見圖2（專利號US6544788）喻圃，該產(chǎn)品能夠?qū)⒛繕?biāo)物質(zhì)，如細(xì)胞粪滤、微生物等斧拍，通過所述的“過濾器”截留在反應(yīng)袋內(nèi)部，同時將廢培養(yǎng)基液體通過“過濾器”排出反應(yīng)器外杖小，并且實現(xiàn)新鮮培養(yǎng)基加入肆汹，從而實現(xiàn)了在Wave Bioreactor®及一次性反應(yīng)袋產(chǎn)品中連續(xù)化灌注培養(yǎng)細(xì)胞及微生物，為微生物培養(yǎng)工藝予权、生物制藥上游細(xì)胞擴(kuò)增工藝提供了有力的工具昂勉。

圖2：帶過濾器的一次性生物反應(yīng)袋示意圖（圖片來源：US6544788）

 

3、一次性灌流生物反應(yīng)袋

該技術(shù)發(fā)展到今天扫腺，最為行業(yè)所熟知的產(chǎn)品硼啤，即為Cytiva公司在售的XuriTM系列一次性灌流生物反應(yīng)袋產(chǎn)品，見圖3斧账。隨著專利US6544788的到期，全球一次性耗材生產(chǎn)商也陸陸續(xù)續(xù)開始了一次性灌流生物反應(yīng)袋產(chǎn)品的開發(fā)和商業(yè)化工作煞肾。

圖3：XuriTM系列一次性灌流生物反應(yīng)袋產(chǎn)品（圖片來自Cytiva）

 

二咧织、一次性灌流生物反應(yīng)袋的基本要求

一次性灌流生物反應(yīng)袋的基本要求，是在產(chǎn)品使用者的生物培養(yǎng)工藝條件下籍救，保證所培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞习绢，達(dá)到預(yù)期的增殖密度，且在該過程中蝙昙，起到截留作用的“過濾器”不堵塞闪萄，即液體能夠在較低的壓力下通過所述過濾裝置，同時奇颠，“過濾器”能夠有效截留被培養(yǎng)物質(zhì)败去，即過濾裝置下游幾乎無微生物或細(xì)胞穿透。因此烈拒，由上述可見圆裕，“過濾器”的截留性能是決定一次性灌流生物反應(yīng)袋能否滿足使用要求的關(guān)鍵核心部件广鳍。

 

三、一次性灌流生物反應(yīng)袋應(yīng)用及挑戰(zhàn)

1吓妆、一次性灌流生物反應(yīng)袋主要應(yīng)用

1. 一次性灌流生物反應(yīng)袋的一個重要應(yīng)用點赊时，位于生物制藥工藝環(huán)節(jié)中的細(xì)胞擴(kuò)增工藝段。
2. 在細(xì)胞擴(kuò)增階段行拢，使用者期望能夠通過灌流培養(yǎng)的工藝祖秒，實現(xiàn)對于CHO等工程細(xì)胞的高密度細(xì)胞培養(yǎng)。

高密度CHO細(xì)胞灌流培養(yǎng)的益處為：

• 一方面舟奠，可以提高細(xì)胞擴(kuò)增效率竭缝，甚至有可能減少1-2個細(xì)胞擴(kuò)增工藝步驟，節(jié)省時間鸭栖、原材料歌馍、金錢、人力成本晕鹊，減少染菌風(fēng)險松却，提高成功率
• 另一方面，在一些利用工程細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)蛋白溅话、收獲病毒載體晓锻、獲得mRNA疫苗的小規(guī)模研產(chǎn)活動中，高細(xì)胞培養(yǎng)密度能夠帶來更高的目標(biāo)物滴度飞几，并提高效率

 

下圖4比較了一個用常規(guī)方法將細(xì)胞擴(kuò)大到500L生產(chǎn)用生物反應(yīng)器（n）中的例子砚哆，使用高密度細(xì)胞庫方法減少了中間兩個轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的步驟，可以直接接種到2L的波浪生物反應(yīng)器中屑墨。使用波浪生物反應(yīng)器（2L和20L）代替轉(zhuǎn)瓶（125ml到10L）大大減少了需要在超凈臺中操作的次數(shù)躁锁。這種替換使整個過程在一個封閉系統(tǒng)中進(jìn)行，提高了操作成功率卵史。

圖4：常規(guī)與改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)工藝過程比較（圖片來源：Bioprocess Int）

 

2战转、一次性灌流生物反應(yīng)袋在高細(xì)胞密度中面臨的挑戰(zhàn)

高細(xì)胞密度對于灌流生物反應(yīng)袋的挑戰(zhàn)是巨大的，尤其當(dāng)細(xì)胞密度上升后以躯，對于過濾部件的壓力尤為明顯槐秧。

• 高細(xì)胞濃度時，過濾部件需要能夠維持灌流工藝的進(jìn)行忧设，此即要求過濾部件面對高濃度料液挑戰(zhàn)時不被堵塞刁标；
• 再者，被培養(yǎng)物址晕，如細(xì)胞膀懈、微生物等由于本身結(jié)構(gòu)柔軟，在較低壓力驅(qū)動下極容易穿透過濾介質(zhì)谨垃。
• 另外一個容易被忽視的地方吏砂，在于灌流生物反應(yīng)袋中的過濾部件在整個培養(yǎng)過程中是隨著Wave Bioreactor®不斷“隨波逐流”的撵儿，長時間的培養(yǎng)需求對過濾部件的機(jī)械可靠性能提出了更高的要求。

綜上狐血，一款合格的適用于Wave Bioreactor®的截留過濾部件需要滿足高載量淀歇、長壽命、高截留效率匈织、高機(jī)械可靠性等要求浪默。邁博瑞基于常年在過濾、分離及純化行業(yè)的積累缀匕，提出了利用深層過濾機(jī)制來應(yīng)對灌流生物反應(yīng)袋過濾部件提出的挑戰(zhàn)纳决，并成功開發(fā)出Cellgard細(xì)胞截留板。

 

三乡小、邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板

邁博瑞開發(fā)的Cellgard細(xì)胞截留板是利用超高分子量聚乙烯粉末燒結(jié)工藝制成的一種深層過濾介質(zhì)阔加，見圖5，有17×17cm和50×30cm兩種尺寸满钟，厚度為3mm胜榔，見圖6。針對生物制藥行業(yè)對于工程細(xì)胞（如CHO DG44細(xì)胞湃番，CHO K1細(xì)胞夭织，HEK 293細(xì)胞等）擴(kuò)增培養(yǎng)的具體需求，Cellgard板材的孔徑被設(shè)計為7μm吠撮，同時尊惰，Cellgard高達(dá)300N/mm的穿刺強(qiáng)度，大大提高了截留部件的機(jī)械可靠性泥兰。這樣的設(shè)計弄屡，能夠良好的滿足灌流生物反應(yīng)袋對截留過濾部件提出的挑戰(zhàn)。在MS與客戶的灌流細(xì)胞培養(yǎng)評測實驗中鞋诗，Cellgard細(xì)胞截留板均完美的實現(xiàn)了不同條件下的細(xì)胞培養(yǎng)并達(dá)到測試預(yù)期琢岩。

圖5：MS Cellgard細(xì)胞截留板

圖6：MS Cellgard細(xì)胞截留板尺寸示意圖

 

四、Cellgard細(xì)胞截留板性能實驗分析

實驗一：2L細(xì)胞培養(yǎng)

圖7：灌流式生物反應(yīng)袋結(jié)構(gòu)示意圖

 

在第一組測試中师脂，尺寸為17×17cm2的Cellgard細(xì)胞截留板被制作成2L灌流式生物反應(yīng)袋（見上示意圖7）。該測試主要考察樣品灌流袋在未有蛋白表達(dá)情況下的細(xì)胞擴(kuò)增情況江锨，所用細(xì)胞株為CHO K1吃警。在設(shè)置的另外兩組平行實驗中，同樣規(guī)格大小的兩個2L灌流反應(yīng)袋分別裝載標(biāo)稱孔徑1微米的微濾膜及競品細(xì)胞截留板作為灌流過濾部件啄育。該測試約定酌心，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞泄露、截留板堵塞挑豌、細(xì)胞活率下降至90%以下等情況時安券，停止實驗墩崩。

在為期8天的培養(yǎng)過程中，裝配有Cellgard細(xì)胞截留板的反應(yīng)袋中的細(xì)胞濃度順利增殖到近120 M/ml的濃度侯勉，Day 7-8的培養(yǎng)中鹦筹，跨膜壓差略微上升，細(xì)胞活率略下降址貌，但是膜后收獲液未見細(xì)胞泄露铐拐，與平行對照組相比，同期細(xì)胞活率未見明顯區(qū)別练对，	裝載微濾膜的反應(yīng)袋Day 5出現(xiàn)嚴(yán)重的堵塞現(xiàn)象且下游伴隨約30%的細(xì)胞泄露遍蟋，細(xì)胞活率較好，	裝載有競品截留板的反應(yīng)袋Day 3出現(xiàn)細(xì)胞泄露螟凭，至Day 5時虚青，泄露率達(dá)30%以上，細(xì)胞活率維持較好螺男，
圖8：Cellgard 2L WAVE 培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度绊谭、細(xì)胞活率、跨膜壓差汪拥、細(xì)胞泄露趨勢圖	圖9：微濾膜 2L WAVE 培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度宪赶、細(xì)胞活率、跨膜壓差脯燃、細(xì)胞泄露趨勢圖	圖10：競品截留板 2L WAVE 培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度欲主、細(xì)胞活率、跨膜壓差逝嚎、細(xì)胞泄露趨勢圖

 

實驗二：50L細(xì)胞培養(yǎng)

第二組測試主要考察被培養(yǎng)的細(xì)胞在表達(dá)蛋白的情況下扁瓢，Cellgard截留板作為過濾部件的表現(xiàn)。所用Cellgard截留板尺寸為30×50cm2补君，反應(yīng)袋體積為50L引几。該培養(yǎng)實驗的預(yù)設(shè)目標(biāo)，是利用灌流式生物反應(yīng)袋將CHO細(xì)胞培養(yǎng)至70 M/ml的細(xì)胞濃度挽铁，并至少維持5天以上伟桅，同時觀察蛋白表達(dá)及收獲液中的蛋白收率情況

本次培養(yǎng)起始階段細(xì)胞接種密度為0.3 M/ml敞掘，3天后細(xì)胞順利進(jìn)入對數(shù)生長期，到Day 10時達(dá)到最高細(xì)胞密度84.7 M/ml楣铁。經(jīng)灌流速率玖雁、供養(yǎng)等參數(shù)調(diào)控后，培養(yǎng)密度順利維持在70 M/ml以上并保持較高的細(xì)胞活率民褂，	同時茄菊，細(xì)胞蛋白表達(dá)亦進(jìn)入對應(yīng)的高峰期。經(jīng)測量反應(yīng)袋內(nèi)及截留板下游蛋白濃度赊堪，可得收獲端蛋白收獲率面殖。Cellgard細(xì)胞截留板上下游幾乎無法測出蛋白濃度差，蛋白收獲率近100%哭廉，見圖12脊僚。該特性相較利用微濾膜、超濾膜技術(shù)實現(xiàn)灌流功能的器件相比遵绰，具有獨特的優(yōu)勢辽幌。	灌流培養(yǎng)進(jìn)行至Day 18時，Cellgard細(xì)胞截留板下游開始探測到有活細(xì)胞穿透椿访，此時對應(yīng)的跨膜壓差增長到50mbar乌企。隨著灌流培養(yǎng)繼續(xù)進(jìn)行，跨膜壓差繼續(xù)增長成玫，細(xì)胞穿透更加明顯加酵，而細(xì)胞蛋白表達(dá)及下游收獲率幾乎不受影響，見圖13哭当。細(xì)胞穿透的原因一般是由于跨膜壓差的驅(qū)動使得細(xì)胞發(fā)生了形變而穿越了截留板的微孔結(jié)構(gòu)猪腕。我們建議用戶在實際培養(yǎng)過程中監(jiān)控跨膜壓差，并根據(jù)實際培養(yǎng)情況調(diào)整培養(yǎng)工藝钦勘。
圖11：50L灌流袋細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度陋葡、細(xì)胞活率趨勢圖	圖12：50L灌流袋細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)與mAB濃度、mAB收獲率趨勢圖	圖13：50L灌流袋細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)與跨膜壓力彻采、收獲液細(xì)胞密度趨勢圖

 

至此腐缤，在兩種不同培養(yǎng)工藝條件下，Cellgard截留板均實現(xiàn)了高細(xì)胞培養(yǎng)密度肛响、高截留率岭粤、長使用壽命的目標(biāo)，培養(yǎng)情況均符合實驗預(yù)期终惑。Cellgard產(chǎn)品能夠為一次性灌流式生物反應(yīng)器的高密度細(xì)胞培養(yǎng)提供有力支撐。應(yīng)當(dāng)注意的是门扇，由于用戶不同的培養(yǎng)工藝可能導(dǎo)致不同的培養(yǎng)結(jié)果雹有，以上兩組實驗數(shù)據(jù)僅供參考偿渡，不可視為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果。 

 

五霸奕、邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板的優(yōu)勢

• 利用深層過濾機(jī)制溜宽，可實現(xiàn)更高密度的細(xì)胞培養(yǎng)，且抗堵塞能力強(qiáng)质帅；
• 更高的機(jī)械強(qiáng)度适揉，避免使用過程中出現(xiàn)因機(jī)械損傷導(dǎo)致的泄露；
• 特殊的孔徑設(shè)計煤惩，避免細(xì)胞泄露前提條件下嫉嘀，對蛋白等目標(biāo)產(chǎn)物幾乎無截留。

 

Cellgard細(xì)胞截留板產(chǎn)品現(xiàn)已開放試用魄揉，歡迎新老客戶咨詢剪侮，產(chǎn)品尺寸可根據(jù)用戶需求進(jìn)行訂制，詳情請咨詢您身邊的MS銷售工程師洛退。

 

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